CRISPR的基因改造技術已經行之有年，其方法是先設計一段guide RNA，guide RNA的設計方式是先找出想要結合的DNA位點，從有PAM標記的位置向前設計20個bp。而PAM大部分用的是化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)的蛋白質Cas 9，辨識位點為NGG (N代表隨意一個鹼基)，網路上已經有很多工具可以進行此項設計，如CRISPR optimal target finder，只要輸入序列就能自動設計完成。
例如將ACE2 gene的CDS序列(轉譯成蛋白質的區域)輸入後，就能得到一段最好的選擇結果。
(CRISPR optimal target finder)
Result display format:
Dist Prox PAM
GATCGATG|TTGAATGCCGAT TGG
人工合成出這段RNA序列後，實驗上只要再接上Cas9蛋白(核酸內切酶)，就可以進行對目標DNA Knockout的動作。而之後缺損的DNA會經由非同源末端連接（NHEJ）或同源性定向修復（HDR）來修復DNA。如果要對基因產生最大功能性破壞將gRNA設計在第一個或第二個exon是較好的選擇，讓基因有較大的機率造成功能性喪失突變。
從以上我們可以發現CRISPR的設計很大限度受限於PAM位點，目前最常用的是NGG，但在不同細菌上的CRISPR有著不同的PAM位點，若能發現更多不同種類的Cas9蛋白，則在遺傳工程上會有更多不同的選擇。
| Species | Subtype | PAM Sequence |
| S. pyogenes | II | 5′-NGG |
| S. solfataricus | I-A1 | 5′-CCN |
| S. solfataricus | I-A2 | 5′-TCN |
| H. walsbyi | I-B | 5′-TTC |
| E. coli | I-E | 5′-AWG |
| E. coli | I-F | 5′-CC |
| P. aeruginosa | I-F | 5′-CC |
| S. Thermophilus | II-A | 5′-NNAGAA |
| S. agelactiae | II-A | 5′-NGG |
而在2020年11月在Nature communications期刊上發表了已無細胞的生化篩選方式，從資料庫中數千種Cas9的蛋白質序列選出了79種來自不同細菌的Cas9蛋白的PAM，並且合成了這79種Cas9蛋白，在每瓶液體中混了隨機PAM序列的蛋白，最終發現至少50種不同的PAM位點，這項研究的貢獻在於目前人類在CRISPR上面只有一把剪刀(NGG)，未來將會有更多的剪刀能用。不過這項研究也只是個開頭，這些Cas9家族有幾個能真正用在實驗室的基因剪輯依然是未知數，期待未來更進一步的研究發展。
另外一個優點則是，過去的研究發現有125名捐血者中有58%都帶有化膿性鏈球菌的抗體，以無害細菌的Cas9蛋白可能較不會引起人體的免疫反應。
A, 使用限制性內切酶的對照顯示，用我們的方法可以回收平末端，5′-突出端和3′-突出端。TS表示最上端鏈；BS表示底部鏈。
B, Spy Cas9和Sau Cas9切割的DNA末端。heatmaps將映射的切割末端表示為五個不同dsDNA目標標中每個位置的平均值。DNA鹼基和原間隔子相鄰基序（PAM）序列的位置顯示在heatmaps上方。NTS表示非目標鏈；TS表示目標鏈。
C, 一個鹼基5′-突出的交錯切割和多個鹼基5′-突出的切割的例子以heatmaps的形式顯示，該圖顯示了五個不同的dsDNA目標中每個位置的平均斷裂末端比例。DNA鹼基和PAM序列的位置顯示在heatmaps上方。NTS表示非目標鏈；TS表示目標鏈。
(A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs)
參考文獻
Gasiunas, G., Young, J. K., Karvelis, T., Kazlauskas, D., Urbaitis, T., Jasnauskaite, M., … & Siksnys, V. (2020). A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs. Nature communications, 11(1), 1-10.
