CRISPR技術的瓶頸與突破

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CRISPR技術概要

CRISPR的基因改造技術已經行之有年,其方法是先設計一段guide RNA,guide RNA的設計方式是先找出想要結合的DNA位點,從有PAM標記的位置向前設計20個bp。而PAM大部分用的是化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)的蛋白質Cas 9,辨識位點為NGG (N代表隨意一個鹼基),網路上已經有很多工具可以進行此項設計,如CRISPR optimal target finder,只要輸入序列就能自動設計完成。

例如將ACE2 gene的CDS序列(轉譯成蛋白質的區域)輸入後,就能得到一段最好的選擇結果。

(addgene-CRISPR Guide)

圖1, gRNA設計工具

(CRISPR optimal target finder)

Result display format:
Dist     Prox         PAM
GATCGATG|TTGAATGCCGAT TGG

人工合成出這段RNA序列後,實驗上只要再接上Cas9蛋白(核酸內切酶),就可以進行對目標DNA Knockout的動作。而之後缺損的DNA會經由非同源末端連接(NHEJ)或同源性定向修復(HDR)來修復DNA。如果要對基因產生最大功能性破壞將gRNA設計在第一個或第二個exon是較好的選擇,讓基因有較大的機率造成功能性喪失突變。

圖2, CRISPR技術概要

從以上我們可以發現CRISPR的設計很大限度受限於PAM位點,目前最常用的是NGG,但在不同細菌上的CRISPR有著不同的PAM位點,若能發現更多不同種類的Cas9蛋白,則在遺傳工程上會有更多不同的選擇。

SpeciesSubtypePAM Sequence
S. pyogenesII5′-NGG
S. solfataricusI-A15′-CCN
S. solfataricusI-A25′-TCN
H. walsbyiI-B5′-TTC
E. coliI-E5′-AWG
E. coliI-F5′-CC
P. aeruginosaI-F5′-CC
S. ThermophilusII-A5′-NNAGAA
S. agelactiaeII-A5′-NGG
表1, 不同細菌上的PAM位點

(泰鼎生物科技公司-CRISPR Cas9)

而在2020年11月在Nature communications期刊上發表了已無細胞的生化篩選方式,從資料庫中數千種Cas9的蛋白質序列選出了79種來自不同細菌的Cas9蛋白的PAM,並且合成了這79種Cas9蛋白,在每瓶液體中混了隨機PAM序列的蛋白,最終發現至少50種不同的PAM位點,這項研究的貢獻在於目前人類在CRISPR上面只有一把剪刀(NGG),未來將會有更多的剪刀能用。不過這項研究也只是個開頭,這些Cas9家族有幾個能真正用在實驗室的基因剪輯依然是未知數,期待未來更進一步的研究發展。

另外一個優點則是,過去的研究發現有125名捐血者中有58%都帶有化膿性鏈球菌的抗體,以無害細菌的Cas9蛋白可能較不會引起人體的免疫反應。

figure5
圖2, 不同的Cas9 切割位點分析,切割位點和所得的雙鏈DNA(dsDNA)末端以heatmaps的方式描繪,顯示了通過DNA測序在目標DNA每個位置的切割比例。藍色的強度表示切割比例。
 

A, 使用限制性內切酶的對照顯示,用我們的方法可以回收平末端,5′-突出端和3′-突出端。TS表示最上端鏈;BS表示底部鏈。


B,  Spy Cas9和Sau Cas9切割的DNA末端。heatmaps將映射的切割末端表示為五個不同dsDNA目標標中每個位置的平均值。DNA鹼基和原間隔子相鄰基序(PAM)序列的位置顯示在heatmaps上方。NTS表示非目標鏈;TS表示目標鏈。

C, 一個鹼基5′-突出的交錯切割和多個鹼基5′-突出的切割的例子以heatmaps的形式顯示,該圖顯示了五個不同的dsDNA目標中每個位置的平均斷裂末端比例。DNA鹼基和PAM序列的位置顯示在heatmaps上方。NTS表示非目標鏈;TS表示目標鏈。    

(A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs)

參考文獻

Gasiunas, G., Young, J. K., Karvelis, T., Kazlauskas, D., Urbaitis, T., Jasnauskaite, M., … & Siksnys, V. (2020). A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs. Nature communications11(1), 1-10.

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